在ELISA實驗操作中,洗滌是一大重點步驟.這一流程主要作用是可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號,從而增加分析的信噪比.每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留,在最后一步產(chǎn)生信號.但是,不充分的洗滌會導(dǎo)致差異和高背景,從而帶來不理想的結(jié)果.那么在ELISA洗滌步驟中需要怎樣正確操作呢？需要洗滌幾次？
據(jù)酶聯(lián)免疫學(xué)第三方檢測中心技術(shù)專員介紹：ELISA通常在96孔板中開展,其上包被了結(jié)合抗原或抗體.在封閉步驟后,包被后的平板首先與一抗或抗原孵育.隨后通過一些洗滌步驟去除未結(jié)合(低親和力)的抗原-抗體復(fù)合物.接著,平板與二抗孵育.這種帶有酶的抗體與高親和力的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合.之后,又是一輪洗滌.最后是添加底物并檢測信號.
洗滌次數(shù)越多,背景越低.然而,太多次的洗滌會降低信號強度,使其難以測定.通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次.不過,ELISA板的制造商會對洗滌次數(shù)提出建議.一般而言,制造商包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少.對于用戶包被的ELISA板,必須優(yōu)化洗滌次數(shù).
控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過量的洗滌液.一般來說,96孔板的每個孔能容納330至460 μl.不過,有些自動化洗板機可設(shè)置程序,分配遠遠超出這個量的洗滌液,比如1ml.它是如何做到的呢？其實很簡單,就是在分液的同時打開吸液功能.換句話說,隨著分液器分配更多的液體,抽吸器也將液體吸出.這種技術(shù)能增加洗滌量,但不會溢出到其他孔中.
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